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一、原理

根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計在某一特定波長測定其吸光度，即可用公式計算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常數(shù)。當溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時，α為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和。這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測定葉綠素a、b時為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

（一）材料：新鮮（或烘干）的植物葉片。

（二）儀器設(shè)備：1）分光光度計；2）電子頂載天平（感量0.01g）；3）研缽；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量濾紙；7）吸水紙； 8）擦境紙；9）滴管。10）葉綠素測定儀（SPAD502葉綠素儀也可）

（三）試劑：1）95%乙醇（或80%丙酮）；2）石英砂；3）碳酸鈣粉。

三、實驗步驟

1）取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，剪碎（去掉中脈），混勻。

2）稱取剪碎的新鮮樣品 0.2g ，共3份，分別放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3ml 95%乙醇，研成均漿，再加乙醇10ml，    繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。

3）取濾紙1張，置漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，過濾到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇沖洗研缽、研棒及 殘渣    數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。

4）用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至25ml，搖勻。

5）把葉綠體色素提取液倒入光徑1cm的比色杯內(nèi)，以95%乙醇為空白，在波長663nm和645nm下測定吸光度。      

四、實驗結(jié)果計算

葉綠素a的含量 = 12.7*OD663 - 2.69*OD645

葉綠素b的含量 = 22.9*OD645 - 4.86*OD663

葉綠素a、b的總含量 = 8.02*OD663 + 20.20*OD645